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產(chǎn)品名稱:鎳-瓊脂糖凝膠6FF(Ni-NTA Resin)

產(chǎn)品型號:P2010-Solarbio

產(chǎn)品報(bào)價(jià):

產(chǎn)品特點(diǎn):鎳-瓊脂糖凝膠6FF(Ni-NTA Resin)
Ni-NTA是用于純化6xHis標(biāo)簽重組蛋白的一種純化介質(zhì),它是由4%交聯(lián)的Sepharose耦連了一種四齒螯合劑NTA而得

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P2010-Solarbio鎳-瓊脂糖凝膠6FF(Ni-NTA Resin)的詳細(xì)資料:

鎳-瓊脂糖凝膠6FF(Ni-NTA Resin)

 

Ni-NTA瓊脂糖凝膠6FF是用于純化6×His標(biāo)簽重組蛋白的一種純化介質(zhì),它是由6%交聯(lián)的Sepharose耦連了一種四齒螯合劑NTA而得. 它可用于在非變性或變性條件下純化任何表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的6×His標(biāo)簽重組蛋白。NTA,含有四個(gè)螯合區(qū),較一般的三齒螯合劑能更好的結(jié)合Ni2+。6×His可與Ni2+螯合,從而使His標(biāo)簽蛋白結(jié)合在Ni-NTA純化介質(zhì)上,未結(jié)合的蛋白被洗滌下去,結(jié)合在介質(zhì)上的蛋白經(jīng)過一定濃度的咪唑或低pH緩沖液的溫和洗脫下來,從而得到高純度的目的蛋白。該純化介質(zhì)與His標(biāo)簽蛋白具有*的親和力,可達(dá)5-20 mg/ml??稍诜亲冃院妥冃詶l件下純化任何表達(dá)系統(tǒng)所得的His標(biāo)簽蛋白。純化程序簡單,所得的蛋白純度可高達(dá)95%。Ni-NTA可再生4-6次,重復(fù)使用。本產(chǎn)品懸浮液為20%乙醇,已螯合Ni2+。

操作方法:

A. 非變性條件下抽提His標(biāo)簽蛋白

1) 準(zhǔn)備細(xì)胞,接種,誘導(dǎo)表達(dá)。收集細(xì)胞,置于-70°C或立即進(jìn)行步驟2操作。

2) 加入1/20細(xì)胞生長體積的NTA-0 Buffer和PMSF。PMSF使用的工作濃度為1 mM現(xiàn)用現(xiàn)加。

3) 將細(xì)胞懸浮起來,加入溶菌酶,混勻,冰上放置30分鐘,超聲或勻漿破碎細(xì)胞。該步驟冰上操作。

4) 加入10% Triton X-100, 使終濃度為0.05%,充分混勻,冰上放置15分鐘。

5) 12000 rpm/min(20,000×g以上),4°C離心15分鐘以上。取上清,置于冰上備用或-20°C保存。

6) 將NTA樹脂裝入合適的層析柱,層析用10倍NTA體積的NTA-0 Buffer洗。

7) 將樣品加NTA層析柱中,流速在15 ml/h左右,收集穿透部分,用SDS/PAGE分析蛋白的結(jié)合情況。

8) 層析用5倍NTA體積的NTA-0 Buffer洗,流速控制在30 ml/h左右。

9) 分別用5倍NTA體積的NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA-80、NTA-100、NTA-200、NTA-1000 Buffer洗脫,流速控制在15 ml/h左右,收集洗脫液,每管收集一個(gè)NTA體積。

10) 確定目標(biāo)蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況。為有效的方式是SDS-PAGE分析。也可以用Bradford 蛋白質(zhì)測定試劑盒,快速確定蛋白質(zhì)的含量,然后用SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的分布。

11)純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)的保存條件需要根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)和用途確定。 NTA-0 、20、40、60、80、100、200、1000Buffer分別為濃度20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,添加0、20、40、60、80、100、200、1000 mM Imidazole。

B.變性條件下從包涵體中純化His標(biāo)簽蛋白

1) 準(zhǔn)備細(xì)胞,接種,誘導(dǎo)表達(dá)。收集細(xì)胞,置于-70°C或立即進(jìn)行步驟2操作。

2) 加入1/20細(xì)胞生長體積的GuNTA-0 Buffer和PMSF。PMSF使用的工作濃度為1 mM現(xiàn)用現(xiàn)加。

3) 將細(xì)胞懸浮起來,冰上超聲破碎細(xì)胞,降低粘稠度。

4) 室溫放置30分鐘,間或混勻或用磁力攪拌。

5) 12000轉(zhuǎn)/分(20,000×g以上),4°C離心15分鐘以上。取上清,置于冰上備用或-20°C保存。

6) 將NTA樹脂裝入合適的層析柱,層析用10倍NTA體積的GuNTA-0 Buffer洗。

7) 將樣品加到NTA層析柱中,流速控制在15 ml/h左右,收集穿透部分,用于SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。

8) 層析用5倍NTA體積的GuNTA-0 Buffer洗,流速控制在30 ml/h左右。

9) 分別用5倍NTA體積GuNTA-20、GuNTA-40,GuNTA-60、GuNTA-100、GuNTA-500洗脫,流速在15 ml/ h左右,收集洗脫液,每管收集一個(gè)NTA體積。

10) 確定目標(biāo)蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況。為有效的方式是SDS/PAGE分析。也可以用Bradford 蛋白質(zhì)測定試劑盒,快速確定蛋白質(zhì)的含量,然后用SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的分布。

11) 目標(biāo)蛋白質(zhì)需要進(jìn)一步純化需要根據(jù)蛋白質(zhì)的用途確定。

12) 純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)需要復(fù)性,復(fù)性常用的手段可以參考有關(guān)手冊確定的原則。

GuNTA-0 、20、40、60、100、500Buffer分別為濃度20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,6 M Guanidium HCl添加0、20、40、60、100、500 mM Imidazole。

C. NTA樹脂的再生

NTA樹脂在使用若干次數(shù)(3-5次)后,結(jié)合效率有所下降,可以用以下方法再生,提高樹脂的使用壽命和蛋白質(zhì)的結(jié)合效率。

NTA樹脂再生前需要從層析柱下端流干所有溶液,估計(jì)出NTA的樹脂體積,按下列次序?qū)⒃偕噭┘拥綄游鲋铮诘壬弦徊皆偕芤毫鞲珊?,再加下一步再生溶解?/p>

用戶需要自行準(zhǔn)備25%、50%、75%、100%(v/v)乙醇和去離子水。 從層析柱下端流干所有溶液,用2倍NTA樹脂體積的Stripping Solution I、2倍體積的去離子水、3倍體積的Stripping Solution II、1倍體積的25%乙醇、1倍體積的50%乙醇、1倍體積的75%乙醇、5倍體積的100%乙醇、1倍體積的75%乙醇、1倍體積的50%乙醇、1倍體積的25%乙醇、1倍體積的去離子水、5倍體積的Stripping Solution III、3倍體積的去離子水分別洗一遍。

如果立即使用,用5倍體積的Ni Charging Solution洗,再用10倍體積的平衡溶液(NTA-0Buffer或GuNTA-0 Buffer)洗;如果想長期儲存,加入1倍體積的20%乙醇,4°C保存,使用前用5倍體積的Ni Charging Solution洗,再用10倍體積的平衡溶液(NTA-0Buffer或GuNTA-0 Buffer)洗

再生溶液配方:Stripping Solution I:  6M GuHCl, 0.2M acetic acid。Stripping Solution II: 2% SDS。        Stripping Solution III: 100 mM EDTA, pH 8.0。Ni Charging Solution: 100 mM NiSO4

鎳-瓊脂糖凝膠6FF(Ni-NTA Resin)

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